دوره 2، شماره 1 - ( 3-1401 )
جلد 2 شماره 1 صفحات 9-1 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Behshood P, Tajbakhsh E, Nourbakhsh F. Prevalence of stx1, stx2 and eaeA genes in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from fish and shrimp in Bushehr. Zoonosis 2022; 2 (1) :1-9
URL: http://zoonosis.ir/article-1-36-fa.html
URL: http://zoonosis.ir/article-1-36-fa.html
بهشود پریسا، تاج بخش الهه، نوربخش فهیمه. فراوانی ژنهای stx1 , stx2 و eaeA در باکتریهای اشریشیا کلی مولد شیگاتوکسین جدا شده از ماهی و میگو در استان بوشهر. مجله بيماری های قابل انتقال بين انسان و حيوان. 1401; 2 (1) :1-9
، Parisa_behshood@yahoo.com
متن کامل [PDF 607 kb]
(368 دریافت)
| چکیده (HTML) (777 مشاهده)
متن کامل: (123 مشاهده)
مقدمه
تاکنون چندین همه‌گیری ناشی از غذا در سراسر جهان به علت اشریشیاکلی مولد توکسین شیگا مشاهده شده است. آلودگی با این ارگانیسم باعث اسهال آبکی و خونی میشود و از عوارض بعدی عفونت با سروتیپ O:157 H:7 این باکتری میتوان به کولیت هموراژیک و سندرم اورمیک همولیتیک اشاره کرد (1). بیش از صد سروتیپ از اشریشیاکلی شناسایی‌شده است که توانایی تولید شیگاتوکسین را داشته و دارای یکی از ژنهای stx1، stx2 یا واریانتهایی از stx2 هستند که محل این ژنها بر روی باکتریوفاژ لیزوژنیک میباشد. علاوه بر تولید توکسین، دیگر فاکتور ویرولانس STEC پروتئینی به نام Intimin با وزن مولکولی 94 کیلو دالتون موجود در غشای خارجی باکتری است که مسئول چسبندگی به سلولهای اپیتلیوم روده میباشد و توسط ژن eae رمز میشود (2). آلودگی انسان با این باکتری از طریق مصرف مواد غذایی و آب آلوده یا انتقال شخص به شخص صورت میگیرد (3). سویههای اشریشیاکلی تولید کننده شیگاتوکسین در اواخر دهه 1970 بهعنوان عامل اتیولوژیک اسهال در کانادا شناسایی شدند (4). سویههای اشریشیاکلی وروتوکسیژنیک، توکسینی ترشح می‌کنند که به دلیل توانایی آن در کشتن سلولهای vero، وروتوکسین و به دلیل شباهت آن به نوروتوکسین شیگای مترشحه از شیگلا دیسانتری تیپ I، توکسین شبیه شیگاتوکسین نامیده شده و سویههای تولیدکننده آن نیز به STEC معروف میباشند. ژن تولیدکننده وروتوکسین بر روی ژنوم باکتریوفاژ معتدل قرار دارد و توسط تبدیل فاژی به اشریشیاکلی وارد میگردد. توکسینهای vero به دو گروه stx2, stx1 تقسیم‌بندی میگردند. وروتوکسین با اثر بر روی RNA ریبوزومی سبب ممانعت از سنتز پروتئینها میشود، توانایی باکتری اشریشیاکلی O:157 H:7 در ایجاد بیماریهای شدید برای انسان، به دلیل ترشح شیگاتوکسینهای stx1 و stx2 یا وروتوکسینهای vt2 و vt10 و واریتههای این توکسین است (5). شناسایی این سویهها بهطور روتین در آزمایشگاهها انجام نمیگیرد و پژوهشگران در‌صدد یافتن راههای ساده برای غربالگری این باکتریها هستند (6). هموژن بودن این سویه ازنظر ژنتیکی سبب یافتن متدهای زیادی برای جداسازی این سویهها نظیر عدم قدرت تخمیر سوربیتول و عدم تولید بتا دیگلوکورونیداز است که بیشتر انواع اشریشیاکلی قادر به انجام آن میباشند. از این جهت با ساختن محیطهای انتخابی نظیر سوربیتولمکانکیآگار، سفیکسیم پتاسیم تلوریت سوربیتولمکانکیآگار و سفکسیم پتاسیم تلوریت رامنوز سوربیتول مکانکی آگار میتوان این سویهها را غربالگری کرد (7). اشریشیاکلی بهعنوان یکی از مهمترین باکتریها بهعنوان شاخص آلودگی مدفوعی نقش حائز اهمیتی را در بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی بر عهده دارد. این باکتری عامل مهم اسهال و اختلالات گوارشی در کشورهای درحال توسعه و مکانهای با فقر بهداشتی است. بیماریهای اسهالی مهمترین مشکل سلامت عمومی در سرتاسر جهان هستند و سالانه منجر به مرگ بیش از دو میلیون نفر در کشورهای در حال توسعه میشوند (8). از آنجاکه تاکنون در مورد فراوانی ژنهای stx1 و stx2 در سویههای شیگاتوکسین اشریشیاکلی جداشده از فرآوردههای دریایی در استان بوشهر، صورت نگرفته است، در این تحقیق بر‌آن شدیم تا ضمن جداسازی این باکتری فراوانی ژنهای stx1، stx2 و eaeA را نیز مورد بررسی قرار‌دهیم.
مواد و روشها
این مطالعه تعداد 400 نمونه از فرآوردههای دریایی (100 نمونه میگو که 50 نمونه بهصورت بستهبندی شده و 50 نمونه بهصورت غیر بستهبندی از مراکز فروش میگو و 300 نمونه ماهی100 نمونه بهصورت بستهبندی شده و 200 نمونه بهصورت غیر بستهبندی از مراکز فروش ماهی) در استان بوشهر تهیه گردید و با رعایت زنجیره سرما و در شرایط استریل به آزمایشگاه کنترل کیفی اداره کل دامپزشکی استان بوشهر انتقال داده شدند.
بهمنظور غنی‌سازی 25 گرم از هر نمونه (از قسمت‌های سطحی و داخلی) جداسازی و به شکل هموژن شده به 225 سی‌سی محیط تریپتیک سوی براث (difco, TSB) حاوی mg/l 20 نووبیوسین کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه گرمخانه گذاری گردید. سپس برای جداسازی باکتری، تمام نمونههای غنی‌شده بر روی محیط سوربیتول مککانکی آگار حاوی 05/ 0 میلی‌گرم در لیتر سفکسیم، 5/2 میلی‌گرم در لیتر تلوریت پتاسیم، کشت داده شدند و پس از 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد کلونیهای سوربیتول منفی، خالص‌سازی گردید. بهمنظور ارزیابی تخمیر لاکتوز و تعیین هویت باکتریهای جداسازی شده از محیط ویولت رد بایل آگار (VRBA Merck) و متیلن بلو آگار (EMB Merck) استفاده شد. درنهایت بهمنظور تشخیص قطعی اشریشیاکلی، از کلنیهای ایزوله تشکیل‌شده بر روی محیط EMB تستهای بیوشیمیایی تأییدی IMVIC و TSI بر روی کلنیها انجام گرفت. بهمنظور تائید تشخیص قطعی باکتری اشریشیاکلی و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن 16srRNA واکنش زنجیرهای پلیمراز صورت پذیرفت (9 و 10). جهت ارزیابی کیفیت DNA استخراج‌شده از نمونههای مورد مطالعه از روش الکتروفورز روی ژل آگاروز استفاده شد. به این منظور 5 میکرولیتر از DNA استخراج‌شده روی ژل یک درصد آگاروز الکتروفورز گردید. بهمنظور کمیت سنجی DNA تخلیص شده از دستگاه بایوفوتومتر استفاده شد و با اندازه‌گیری میزان DNA در نمونه در طول‌موج نوری 280 نانومتر میزان DNA موجود در نمونه تعیین گردید. نمونه DNA هایی که دارای کیفیت مناسب و کمیتی معادل 50 نانوگرم بودند جهت مراحل بعدی و انجام آزمایش PCR انتخاب گردیدند. آزمایش PCR بهمنظور تشخیص قطعی اشریشیاکلی با استفاده از کیت Accupower PCR PreMix ساخت BioNEER در حجم نهایی 20 میکرولیتر با افزودن 2 میکرولیتر از پرایمرهای F و R، یک میکرولیتر از DNA الگو و 17 میکرولیتر آب مقطر به محتویات کیت Accupower PCR PreMix انجام گرفت .ترکیبات موجود در کیت در جدول شماره یک نشان داده‌شده است. تمام نمونههای باکتری اشرشیاکلی با تکثیر PCR قطعه 200 جفت باز ژن 16srRNA تایید شدند. در این تحقیق اشرشیاکلی ATCC 25922 و سودوموناس آئروژینوزا ATCC 27853 به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و منفی در نظر گرفته شدند (9).
جدول 1. اجزای کیت Accupower PCR PreMix
برنامه حرارتی برای تکثیر ژن 16srRNA بهصورت 94 درجه به مدت 5 دقیقه،30 سیکل تکراری 94 درجه به مدت 15 ثانیه، 60 درجه به مدت 60 ثانیه و 72 درجه به مدت 60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه به مدت 5 دقیقه انجام شد. مشاهده باند 200 جفت بازی نشان‌دهنده مثبت بودن تست است (9). بهمنظور بررسی ژنهای stx1، stx2 و eaeA در حضور زوج پرایمرهای نشان داده‌شده در جدول شماره دو واکنش PCR صورت پذیرفت.
جدول2. توالی پرایمر های مورداستفاده برای ردیابی ژنهای stx1، stx2 و eaeA در ایزولههای اشریشیاکلی.
آزمایش PCR بهمنظور تشخیص ژنهای stx1، stx2 و eaeA با استفاده از کیت Accupower PCR PreMix ساخت BioNEER در حجم نهایی 50 میکرولیتر با افزودن 20پیکومول از پرایمرهای F و R، 4 میکرولیتر از DNA الگو و 1 واحد آنزیم تک پلیمراز به محتویات کیت انجام گرفت. برنامه حرارتی برای تکثیر ژنهای stx1، stx2، eaeA بهصورت 95 درجه به مدت 3 دقیقه،30 سیکل تکراری 95 درجه به مدت 20 ثانیه، 58 درجه به مدت 40 ثانیه و 72 درجه به مدت 90 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه به مدت 5 دقیقه انجام شد. بهمنظور تائید وجود قطعه تکثیرشده از الکتروفورز محلول PCR روی ژل آگارز 5/1درصد استفاده شد (11).
نتـایج
مطالعه حاضر با هدف تعیین فراوانی ژنهای stx1، stx2، eaeA در ایزولههای اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین جداشده از ماهی و میگو استان بوشهر در فصل بهار انجام گرفت. پس از بررسی نمونههای گرمخانه گذاری شده در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط EMB آگار، نمونههایی که کلنی سبزرنگ دارای جلای فلزی داشتند، بهعنوان باکتری اشریشیاکلی، در نظر گرفته شدند. در نمونههایی که بهصورت بستهبندی مورد بررسی قرار گرفتند، باکتری اشریشیاکلی جدا نگردید اما در نمونههای غیر بستهبندی از تعداد 200 نمونه ماهی مورد بررسی در 35 نمونه (5/17درصد) اشریشیاکلی جداسازی و از 50 نمونه میگوی مورد بررسی در 10 نمونه (20درصد) اشریشیاکلی جداسازی گردید. از 35 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از ماهی، 10 ایزوله دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند و از 10 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از میگو سه ایزوله دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند و در محیط EMB جلای سبز فلزی نشان دادند. نتایج در جدول 3 نشان داده‌شده است.
جدول 3. تعداد و درصد موارد مثبت سویههای مولد شیگاتوکسین و سویههای غیر شیگاتوکسین در ایزولههای اشریشیاکلی از نمونههای غیر بسته‌بندی‌شده.
پس از انجام آزمون PCR بهمنظور تشخیص قطعی اشریشیاکلی و حضور توالی ژن 16SrRNA، در 45 نمونه مورد بررسی مثبت تشخیص داده شد. مشاهده باند 200 جفت بازی نشان‌دهنده مثبت بودن این تست میباشد. پس از انجام آزمون Multiplex PCR در حضور پرایمرهای اختصاصی، از 35 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از 200 نمونه ماهی بستهبندی نشده، 10 ایزوله STEC بوده که باندهای مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA به تنهایی در هیچ نمونهایی یافت نشد. در 2 ایزوله (20درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، eaeA و در 1 ایزوله (10درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA مشاهده گردید؛ بنابراین ژن stx1 در 3 نمونه (30درصد)، ژن stx2 در یک نمونه (10درصد) و ژن eaeA در 3 نمونه (30درصد) در ماهی یافت شد. در 3 ایزوله اشریشیاکلی ETEC جداشده از 50 نمونه میگوی بستهبندی نشده، تنها در 1 نمونه ژن stx1 (33/33 درصد) مشاهده گردید. درنتیجه از 13 ایزوله اشریشیاکلی ETEC جداشده از 250 نمونه فرآوردههای دریایی بستهبندی نشده، باندهای مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA به‌تنهایی در یک نمونه (69/7 درصد) یافت شد. در 2 ایزوله (38/15درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، eaeA و در 1 ایزوله (69/7درصد) باندهای مربوط به هر سه ژن stx1، stx2 و eaeA مشاهده گردیدند؛ بنابراین ژن stx1 در 3 نمونه (76/30درصد)، ژن stx2 در 1 نمونه (69/7 درصد) و ژن eaeA در 3 نمونه (07/23 درصد) در فرآوردههای دریایی یافت شد.
بحث
دریای عمان و خلیج‌فارس، این آبراه سرشار از مواهب خدادادی، با مساحتی حدود 239000 کیلومترمربع و مرز آبی حدود 1800 کیلومتر، از دماغه گواتر آغاز و تا اروندرود ادامه یافته است. این آبراه حساس اقتصادی با عمقی حدود 70 تا 90 متر، از دیرباز مسیر داد و ستد و مرکز تمدن و پیشرفت بشر بوده و هست. عمق سواحل آن کم است و از 20 متر تجاوز نمی‌کند، لذا ازنظر صیادی و بهره‌برداری از منابع دریایی و صید ماهی و میگو اهمیت ویژه‌ای دارد. با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی و میگو در این تحقیق بر آن شدیم تا به فراوانی بعضی از فاکتورهای ویرولانس در ایزولههای اشریشیاکلی جداشده از ماهی و میگو در استان بوشهر بپردازیم. اشریشیاکلی عموماً بهعنوان بخشی از فلور میکروبی طبیعی روده انسان و بسیاری از حیوانات محسوب میشود، به این علت نقش مهمی را در میکروب‌شناسی غذا و آب بهعنوان شاخص آلودگی مدفوعی به عهده دارد. سویههای اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین از مهمترین باکتریهای بیماریزای منتقل‌شونده بهوسیله مواد غذایی هستند. این سویهها باکتریهای کومانسال نشخوارکنندگان و گوسانان میباشند که از طریق مواد غذایی به‌ویژه گوشت‌های نیم‌پز مانند همبرگر و سبزی‌ها خام مانند کاهو و اسفناج به انسان منتقل میشوند (12).
تحقیقات محدودی در مورد بررسی فراوانی ژنهای ویرولانس در سویههای STEC جداشده از فرآوردههای دریایی صورت گرفته است. در این تحقیق که برای اولین بار در استان بوشهر صورت گرفت، از 250 نمونه فرآوردههای دریایی غیر بسته‌بندی‌شده، 45 نمونه (18درصد) آلوده به اشریشیاکلی بوده و از این تعداد 13 ایزوله (89/28درصد) STEC بودند. از 200 نمونه ماهی که بهصورت غیر بستهبندی تهیه‌شده بود، در 35 نمونه (5/17درصد) اشریشیاکلی جداسازی گردید و از 50 نمونه میگوی غیر بستهبندی موردبررسی در 10 نمونه (20درصد) اشریشیاکلی جداسازی گردید. از 35 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از ماهی، 10 ایزوله (57/28 درصد) دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند و از 10 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از میگو 3 ایزوله (30 درصد) دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند که بهعنوان سویههای مولد شیگاتوکسین مورد بررسی قرار گرفتند. پس از انجام آزمون PCR بهمنظور بررسی فراوانی ژنهای stx1، stx2 و eaeA در ایزولههای مولد شیگاتوکسین جداشده از ماهی، ژنهای stx1 و eaeA در 2 ایزوله (20 درصد) و ژنهای stx1، stx2 و eaeA باهم در یک ایزوله (10درصد) مشاهده گردیدند؛ اما در ایزولههای جداشده از میگو تنها در یک نمونه (33/33 درصد) ژن stx1 مشاهده گردید. درنتیجه از 13 ایزوله اشریشیاکلی ETEC جداشده از 250 نمونه فرآوردههای دریایی بستهبندی نشده، باندهای مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA به تنهایی در یک نمونه (69/7 درصد) یافت شد. در 2 ایزوله (38/15درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، eaeA و در یک ایزوله (69/7درصد) باندهای مربوط به هر سه ژن stx1، stx2 و eaeA مشاهده گردیدند؛ بنابراین ژن stx1 در 3 نمونه (76/30 درصد)، ژن stx2 در یک نمونه (69/7 درصد) و ژن eaeA در 3 نمونه (07/23 درصد) در فرآوردههای دریایی یافت شد. برخی از سویههای مولد شیگاتوکسین هیچ‌کدام از ژنهای موردنظر را نداشتند و همچنین به‌ندرت سویه‌هایی دیده میشود که تمامی ژنها را داشته باشند. سویه‌هایی که همزمان دارای چند ژن باشند، بهعنوان سویههای با بیماری‌زایی بیشتر در نظر گرفته میشوند. مطالعات محققان دیگر درزمینه‌ی میزان آلودگی ماهی به باکتری اشریشیاکلی نشان‌دهنده بالاتر بودن میزان آلودگی نسبت به تحقیق ما هست، بهطوریکه Gupta و همکاران آلودگی به اشریشیاکلی را در 96 نمونه ماهی را 95/48درصد گزارش کردند که نسبت به تحقیق ما بسیار بالاتر میباشد. در همین تحقیق فراوانی ژن stx1 59/76 درصد و فراوانی ژن stx2 06/51 درصد گزارش گردید درحالی‌که 03/37 درصد از نمونه‌ها همزمان دو ژن stx1 و stx2 را داشتند (13).
مطالعات انجام‌شده در ایران بهمنظور بررسی فراوانی ژنهای ویرولانس در باکتری اشریشیاکلی بیشتر بر روی گوشت و یا فرآوردههای لبنی صورت گرفته است، بهطوریکه در این مطالعات مشخص گردیده معمولاً در طی کشتار، پوست گاوسانان با این باکتری آلوده میشوند و بهعنوان یک فاکتور خطر برای آلوده نمودن محصولات گوشتی دارای اهمیت میباشد. بهطوریکه Barkocy در سال 2003 میزان آلودگی پوست گاو با اشریشیاکلی E.coli O157:H7 را 6/60 درصد گزارش کردند (14). در تحقیق انجام‌شده توسط کارگر و همکاران در سال 1392 از 428 نمونه همبرگر جمع‌آوری شده در شیراز 264 نمونه (68/61 درصد) بهعنوان باکتری اشریشیاکلی تولیدکننده شیگاتوکسین تشخیص داده شدند، که با انجام تست تأییدی 5 نمونه (89/1 درصد) باکتری اشریشیاکلی O157 H7 تشخیص داده شدند. در این تحقیق 2 ایزوله (76/0درصد) دارای ژنهای stx1 و eaeA بودند (15). در تحقیق انجام‌شده توسط Sanath Kumar و همکاران در 2009 بر روی آلودگی ماهی و صدف، سویههای STEC اشریشیاکلی به ترتیب 3 درصد و 5 درصد گزارش گردید در این تحقیق سروتیپ O69 بهعنوان غالب‌ترین سروتیپ مشخص گردید (16).
نتیجه گیری کلـی و پیشنهادها
در این تحقیق و تحقیقات محققان دیگر مشخص گردید که فراوانی ژن stx1 از ژن stx2 بیشتر میباشد. به‌این‌ترتیب میتوان بیان نمود که الگوی ژنتیکی غالب stx1 میباشد. سروتیپ بسیار مهم اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین E. coli O:157 H:7 میباشد که بهطور طبیعی در گاوسانان وجود دارد. مطالعات نشان داده است که حداکثر دفع این باکتری از طریق مدفوعی طی تابستان و اوایل پاییز صورت میگیرد و از صفر تا 61 درصد در مزارع دامی متغیر است و همچنین تحقیقات نشان میدهد که بیشترین میزان جداسازی این باکتری در ماههای گرم سال صورت میگیرد. با توجه به دوز عفونی اندک سویه های مولد شیگاتوکسین باکتری اشریشیاکلی پایش مستمر و همزمان انواع نمونههای مواد غذایی و کلینیکی در تمام نقاط کشور توصیه می شود.
تقـدیر و تشـکر
از تمامی کسانی که در جمع آوری نمونه برای این پژوهش یاری رساندهاند تشکر مینماییم.
تعارض منافع
هیچگونه تضاد منافعی بین نویسندگان وجود ندارد و این مقاله با اطلاع و هماهنگی آنها ارسال شده است.
تاکنون چندین همه‌گیری ناشی از غذا در سراسر جهان به علت اشریشیاکلی مولد توکسین شیگا مشاهده شده است. آلودگی با این ارگانیسم باعث اسهال آبکی و خونی میشود و از عوارض بعدی عفونت با سروتیپ O:157 H:7 این باکتری میتوان به کولیت هموراژیک و سندرم اورمیک همولیتیک اشاره کرد (1). بیش از صد سروتیپ از اشریشیاکلی شناسایی‌شده است که توانایی تولید شیگاتوکسین را داشته و دارای یکی از ژنهای stx1، stx2 یا واریانتهایی از stx2 هستند که محل این ژنها بر روی باکتریوفاژ لیزوژنیک میباشد. علاوه بر تولید توکسین، دیگر فاکتور ویرولانس STEC پروتئینی به نام Intimin با وزن مولکولی 94 کیلو دالتون موجود در غشای خارجی باکتری است که مسئول چسبندگی به سلولهای اپیتلیوم روده میباشد و توسط ژن eae رمز میشود (2). آلودگی انسان با این باکتری از طریق مصرف مواد غذایی و آب آلوده یا انتقال شخص به شخص صورت میگیرد (3). سویههای اشریشیاکلی تولید کننده شیگاتوکسین در اواخر دهه 1970 بهعنوان عامل اتیولوژیک اسهال در کانادا شناسایی شدند (4). سویههای اشریشیاکلی وروتوکسیژنیک، توکسینی ترشح می‌کنند که به دلیل توانایی آن در کشتن سلولهای vero، وروتوکسین و به دلیل شباهت آن به نوروتوکسین شیگای مترشحه از شیگلا دیسانتری تیپ I، توکسین شبیه شیگاتوکسین نامیده شده و سویههای تولیدکننده آن نیز به STEC معروف میباشند. ژن تولیدکننده وروتوکسین بر روی ژنوم باکتریوفاژ معتدل قرار دارد و توسط تبدیل فاژی به اشریشیاکلی وارد میگردد. توکسینهای vero به دو گروه stx2, stx1 تقسیم‌بندی میگردند. وروتوکسین با اثر بر روی RNA ریبوزومی سبب ممانعت از سنتز پروتئینها میشود، توانایی باکتری اشریشیاکلی O:157 H:7 در ایجاد بیماریهای شدید برای انسان، به دلیل ترشح شیگاتوکسینهای stx1 و stx2 یا وروتوکسینهای vt2 و vt10 و واریتههای این توکسین است (5). شناسایی این سویهها بهطور روتین در آزمایشگاهها انجام نمیگیرد و پژوهشگران در‌صدد یافتن راههای ساده برای غربالگری این باکتریها هستند (6). هموژن بودن این سویه ازنظر ژنتیکی سبب یافتن متدهای زیادی برای جداسازی این سویهها نظیر عدم قدرت تخمیر سوربیتول و عدم تولید بتا دیگلوکورونیداز است که بیشتر انواع اشریشیاکلی قادر به انجام آن میباشند. از این جهت با ساختن محیطهای انتخابی نظیر سوربیتولمکانکیآگار، سفیکسیم پتاسیم تلوریت سوربیتولمکانکیآگار و سفکسیم پتاسیم تلوریت رامنوز سوربیتول مکانکی آگار میتوان این سویهها را غربالگری کرد (7). اشریشیاکلی بهعنوان یکی از مهمترین باکتریها بهعنوان شاخص آلودگی مدفوعی نقش حائز اهمیتی را در بهداشت و کنترل کیفی مواد غذایی بر عهده دارد. این باکتری عامل مهم اسهال و اختلالات گوارشی در کشورهای درحال توسعه و مکانهای با فقر بهداشتی است. بیماریهای اسهالی مهمترین مشکل سلامت عمومی در سرتاسر جهان هستند و سالانه منجر به مرگ بیش از دو میلیون نفر در کشورهای در حال توسعه میشوند (8). از آنجاکه تاکنون در مورد فراوانی ژنهای stx1 و stx2 در سویههای شیگاتوکسین اشریشیاکلی جداشده از فرآوردههای دریایی در استان بوشهر، صورت نگرفته است، در این تحقیق بر‌آن شدیم تا ضمن جداسازی این باکتری فراوانی ژنهای stx1، stx2 و eaeA را نیز مورد بررسی قرار‌دهیم.
مواد و روشها
این مطالعه تعداد 400 نمونه از فرآوردههای دریایی (100 نمونه میگو که 50 نمونه بهصورت بستهبندی شده و 50 نمونه بهصورت غیر بستهبندی از مراکز فروش میگو و 300 نمونه ماهی100 نمونه بهصورت بستهبندی شده و 200 نمونه بهصورت غیر بستهبندی از مراکز فروش ماهی) در استان بوشهر تهیه گردید و با رعایت زنجیره سرما و در شرایط استریل به آزمایشگاه کنترل کیفی اداره کل دامپزشکی استان بوشهر انتقال داده شدند.
بهمنظور غنی‌سازی 25 گرم از هر نمونه (از قسمت‌های سطحی و داخلی) جداسازی و به شکل هموژن شده به 225 سی‌سی محیط تریپتیک سوی براث (difco, TSB) حاوی mg/l 20 نووبیوسین کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه گرمخانه گذاری گردید. سپس برای جداسازی باکتری، تمام نمونههای غنی‌شده بر روی محیط سوربیتول مککانکی آگار حاوی 05/ 0 میلی‌گرم در لیتر سفکسیم، 5/2 میلی‌گرم در لیتر تلوریت پتاسیم، کشت داده شدند و پس از 24 ساعت گرمخانه‌گذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد کلونیهای سوربیتول منفی، خالص‌سازی گردید. بهمنظور ارزیابی تخمیر لاکتوز و تعیین هویت باکتریهای جداسازی شده از محیط ویولت رد بایل آگار (VRBA Merck) و متیلن بلو آگار (EMB Merck) استفاده شد. درنهایت بهمنظور تشخیص قطعی اشریشیاکلی، از کلنیهای ایزوله تشکیل‌شده بر روی محیط EMB تستهای بیوشیمیایی تأییدی IMVIC و TSI بر روی کلنیها انجام گرفت. بهمنظور تائید تشخیص قطعی باکتری اشریشیاکلی و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن 16srRNA واکنش زنجیرهای پلیمراز صورت پذیرفت (9 و 10). جهت ارزیابی کیفیت DNA استخراج‌شده از نمونههای مورد مطالعه از روش الکتروفورز روی ژل آگاروز استفاده شد. به این منظور 5 میکرولیتر از DNA استخراج‌شده روی ژل یک درصد آگاروز الکتروفورز گردید. بهمنظور کمیت سنجی DNA تخلیص شده از دستگاه بایوفوتومتر استفاده شد و با اندازه‌گیری میزان DNA در نمونه در طول‌موج نوری 280 نانومتر میزان DNA موجود در نمونه تعیین گردید. نمونه DNA هایی که دارای کیفیت مناسب و کمیتی معادل 50 نانوگرم بودند جهت مراحل بعدی و انجام آزمایش PCR انتخاب گردیدند. آزمایش PCR بهمنظور تشخیص قطعی اشریشیاکلی با استفاده از کیت Accupower PCR PreMix ساخت BioNEER در حجم نهایی 20 میکرولیتر با افزودن 2 میکرولیتر از پرایمرهای F و R، یک میکرولیتر از DNA الگو و 17 میکرولیتر آب مقطر به محتویات کیت Accupower PCR PreMix انجام گرفت .ترکیبات موجود در کیت در جدول شماره یک نشان داده‌شده است. تمام نمونههای باکتری اشرشیاکلی با تکثیر PCR قطعه 200 جفت باز ژن 16srRNA تایید شدند. در این تحقیق اشرشیاکلی ATCC 25922 و سودوموناس آئروژینوزا ATCC 27853 به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و منفی در نظر گرفته شدند (9).
جدول 1. اجزای کیت Accupower PCR PreMix
| Component | 20 μl Reaction |
| Taq DNA Polymerase | U 1 |
| Each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTp) | μM 250 |
| Tris-HCl (pH=9) | mM 10 |
| KCl | mM 30 |
| MgCl2 | mM 1.5 |
| Stabilizer and tracking |
برنامه حرارتی برای تکثیر ژن 16srRNA بهصورت 94 درجه به مدت 5 دقیقه،30 سیکل تکراری 94 درجه به مدت 15 ثانیه، 60 درجه به مدت 60 ثانیه و 72 درجه به مدت 60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه به مدت 5 دقیقه انجام شد. مشاهده باند 200 جفت بازی نشان‌دهنده مثبت بودن تست است (9). بهمنظور بررسی ژنهای stx1، stx2 و eaeA در حضور زوج پرایمرهای نشان داده‌شده در جدول شماره دو واکنش PCR صورت پذیرفت.
جدول2. توالی پرایمر های مورداستفاده برای ردیابی ژنهای stx1، stx2 و eaeA در ایزولههای اشریشیاکلی.
| Size of product (bp) | Annealing (°C) | Sequence (5’–3’) | Gene | |
| 614 | 58 |
F: ACACTGGATGATCTCAGTGG R: CTGAATCCCCCTCCATTATG |
Stx1 | |
| 779 | 58 | F: CCATGACAACGGACAGCAGTT R: CCTGTCAACTGAGCAGCACTTTG |
Stx2 | |
| 890 | 58 | F: GTGGCGAATACTGGCGAGACT R: CCCCATTCTTTTTCACCGTCG |
eaeA | |
| 200 | - | 16S-F, GCGGACGGGTGAGTAATGT 16S-R, TCATCCTCTCAGACCAGCTA |
16srRNA |
نتـایج
مطالعه حاضر با هدف تعیین فراوانی ژنهای stx1، stx2، eaeA در ایزولههای اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین جداشده از ماهی و میگو استان بوشهر در فصل بهار انجام گرفت. پس از بررسی نمونههای گرمخانه گذاری شده در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیط EMB آگار، نمونههایی که کلنی سبزرنگ دارای جلای فلزی داشتند، بهعنوان باکتری اشریشیاکلی، در نظر گرفته شدند. در نمونههایی که بهصورت بستهبندی مورد بررسی قرار گرفتند، باکتری اشریشیاکلی جدا نگردید اما در نمونههای غیر بستهبندی از تعداد 200 نمونه ماهی مورد بررسی در 35 نمونه (5/17درصد) اشریشیاکلی جداسازی و از 50 نمونه میگوی مورد بررسی در 10 نمونه (20درصد) اشریشیاکلی جداسازی گردید. از 35 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از ماهی، 10 ایزوله دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند و از 10 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از میگو سه ایزوله دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند و در محیط EMB جلای سبز فلزی نشان دادند. نتایج در جدول 3 نشان داده‌شده است.
جدول 3. تعداد و درصد موارد مثبت سویههای مولد شیگاتوکسین و سویههای غیر شیگاتوکسین در ایزولههای اشریشیاکلی از نمونههای غیر بسته‌بندی‌شده.
| Serotype | تعداد و درصد موارد مثبت در نمونههای ماهی | تعداد و درصد موارد مثبت در نمونههای میگو |
| STEC | 10 | 3 |
| 5درصد | 6درصد | |
| Non STEC | 25 | 7درصد |
| 5/12درصد | 14درصد | |
| Total | 35 | 10درصد |
| 5/17درصد |
20درصد |
پس از انجام آزمون PCR بهمنظور تشخیص قطعی اشریشیاکلی و حضور توالی ژن 16SrRNA، در 45 نمونه مورد بررسی مثبت تشخیص داده شد. مشاهده باند 200 جفت بازی نشان‌دهنده مثبت بودن این تست میباشد. پس از انجام آزمون Multiplex PCR در حضور پرایمرهای اختصاصی، از 35 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از 200 نمونه ماهی بستهبندی نشده، 10 ایزوله STEC بوده که باندهای مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA به تنهایی در هیچ نمونهایی یافت نشد. در 2 ایزوله (20درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، eaeA و در 1 ایزوله (10درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA مشاهده گردید؛ بنابراین ژن stx1 در 3 نمونه (30درصد)، ژن stx2 در یک نمونه (10درصد) و ژن eaeA در 3 نمونه (30درصد) در ماهی یافت شد. در 3 ایزوله اشریشیاکلی ETEC جداشده از 50 نمونه میگوی بستهبندی نشده، تنها در 1 نمونه ژن stx1 (33/33 درصد) مشاهده گردید. درنتیجه از 13 ایزوله اشریشیاکلی ETEC جداشده از 250 نمونه فرآوردههای دریایی بستهبندی نشده، باندهای مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA به‌تنهایی در یک نمونه (69/7 درصد) یافت شد. در 2 ایزوله (38/15درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، eaeA و در 1 ایزوله (69/7درصد) باندهای مربوط به هر سه ژن stx1، stx2 و eaeA مشاهده گردیدند؛ بنابراین ژن stx1 در 3 نمونه (76/30درصد)، ژن stx2 در 1 نمونه (69/7 درصد) و ژن eaeA در 3 نمونه (07/23 درصد) در فرآوردههای دریایی یافت شد.
بحث
دریای عمان و خلیج‌فارس، این آبراه سرشار از مواهب خدادادی، با مساحتی حدود 239000 کیلومترمربع و مرز آبی حدود 1800 کیلومتر، از دماغه گواتر آغاز و تا اروندرود ادامه یافته است. این آبراه حساس اقتصادی با عمقی حدود 70 تا 90 متر، از دیرباز مسیر داد و ستد و مرکز تمدن و پیشرفت بشر بوده و هست. عمق سواحل آن کم است و از 20 متر تجاوز نمی‌کند، لذا ازنظر صیادی و بهره‌برداری از منابع دریایی و صید ماهی و میگو اهمیت ویژه‌ای دارد. با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی و میگو در این تحقیق بر آن شدیم تا به فراوانی بعضی از فاکتورهای ویرولانس در ایزولههای اشریشیاکلی جداشده از ماهی و میگو در استان بوشهر بپردازیم. اشریشیاکلی عموماً بهعنوان بخشی از فلور میکروبی طبیعی روده انسان و بسیاری از حیوانات محسوب میشود، به این علت نقش مهمی را در میکروب‌شناسی غذا و آب بهعنوان شاخص آلودگی مدفوعی به عهده دارد. سویههای اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین از مهمترین باکتریهای بیماریزای منتقل‌شونده بهوسیله مواد غذایی هستند. این سویهها باکتریهای کومانسال نشخوارکنندگان و گوسانان میباشند که از طریق مواد غذایی به‌ویژه گوشت‌های نیم‌پز مانند همبرگر و سبزی‌ها خام مانند کاهو و اسفناج به انسان منتقل میشوند (12).
تحقیقات محدودی در مورد بررسی فراوانی ژنهای ویرولانس در سویههای STEC جداشده از فرآوردههای دریایی صورت گرفته است. در این تحقیق که برای اولین بار در استان بوشهر صورت گرفت، از 250 نمونه فرآوردههای دریایی غیر بسته‌بندی‌شده، 45 نمونه (18درصد) آلوده به اشریشیاکلی بوده و از این تعداد 13 ایزوله (89/28درصد) STEC بودند. از 200 نمونه ماهی که بهصورت غیر بستهبندی تهیه‌شده بود، در 35 نمونه (5/17درصد) اشریشیاکلی جداسازی گردید و از 50 نمونه میگوی غیر بستهبندی موردبررسی در 10 نمونه (20درصد) اشریشیاکلی جداسازی گردید. از 35 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از ماهی، 10 ایزوله (57/28 درصد) دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند و از 10 ایزوله اشریشیاکلی جداشده از میگو 3 ایزوله (30 درصد) دارای واکنش سوربیتول منفی و واکنش لاکتوز مثبت داشتند که بهعنوان سویههای مولد شیگاتوکسین مورد بررسی قرار گرفتند. پس از انجام آزمون PCR بهمنظور بررسی فراوانی ژنهای stx1، stx2 و eaeA در ایزولههای مولد شیگاتوکسین جداشده از ماهی، ژنهای stx1 و eaeA در 2 ایزوله (20 درصد) و ژنهای stx1، stx2 و eaeA باهم در یک ایزوله (10درصد) مشاهده گردیدند؛ اما در ایزولههای جداشده از میگو تنها در یک نمونه (33/33 درصد) ژن stx1 مشاهده گردید. درنتیجه از 13 ایزوله اشریشیاکلی ETEC جداشده از 250 نمونه فرآوردههای دریایی بستهبندی نشده، باندهای مربوط به ژنهای stx1، stx2 و eaeA به تنهایی در یک نمونه (69/7 درصد) یافت شد. در 2 ایزوله (38/15درصد) باند مربوط به ژنهای stx1، eaeA و در یک ایزوله (69/7درصد) باندهای مربوط به هر سه ژن stx1، stx2 و eaeA مشاهده گردیدند؛ بنابراین ژن stx1 در 3 نمونه (76/30 درصد)، ژن stx2 در یک نمونه (69/7 درصد) و ژن eaeA در 3 نمونه (07/23 درصد) در فرآوردههای دریایی یافت شد. برخی از سویههای مولد شیگاتوکسین هیچ‌کدام از ژنهای موردنظر را نداشتند و همچنین به‌ندرت سویه‌هایی دیده میشود که تمامی ژنها را داشته باشند. سویه‌هایی که همزمان دارای چند ژن باشند، بهعنوان سویههای با بیماری‌زایی بیشتر در نظر گرفته میشوند. مطالعات محققان دیگر درزمینه‌ی میزان آلودگی ماهی به باکتری اشریشیاکلی نشان‌دهنده بالاتر بودن میزان آلودگی نسبت به تحقیق ما هست، بهطوریکه Gupta و همکاران آلودگی به اشریشیاکلی را در 96 نمونه ماهی را 95/48درصد گزارش کردند که نسبت به تحقیق ما بسیار بالاتر میباشد. در همین تحقیق فراوانی ژن stx1 59/76 درصد و فراوانی ژن stx2 06/51 درصد گزارش گردید درحالی‌که 03/37 درصد از نمونه‌ها همزمان دو ژن stx1 و stx2 را داشتند (13).
مطالعات انجام‌شده در ایران بهمنظور بررسی فراوانی ژنهای ویرولانس در باکتری اشریشیاکلی بیشتر بر روی گوشت و یا فرآوردههای لبنی صورت گرفته است، بهطوریکه در این مطالعات مشخص گردیده معمولاً در طی کشتار، پوست گاوسانان با این باکتری آلوده میشوند و بهعنوان یک فاکتور خطر برای آلوده نمودن محصولات گوشتی دارای اهمیت میباشد. بهطوریکه Barkocy در سال 2003 میزان آلودگی پوست گاو با اشریشیاکلی E.coli O157:H7 را 6/60 درصد گزارش کردند (14). در تحقیق انجام‌شده توسط کارگر و همکاران در سال 1392 از 428 نمونه همبرگر جمع‌آوری شده در شیراز 264 نمونه (68/61 درصد) بهعنوان باکتری اشریشیاکلی تولیدکننده شیگاتوکسین تشخیص داده شدند، که با انجام تست تأییدی 5 نمونه (89/1 درصد) باکتری اشریشیاکلی O157 H7 تشخیص داده شدند. در این تحقیق 2 ایزوله (76/0درصد) دارای ژنهای stx1 و eaeA بودند (15). در تحقیق انجام‌شده توسط Sanath Kumar و همکاران در 2009 بر روی آلودگی ماهی و صدف، سویههای STEC اشریشیاکلی به ترتیب 3 درصد و 5 درصد گزارش گردید در این تحقیق سروتیپ O69 بهعنوان غالب‌ترین سروتیپ مشخص گردید (16).
نتیجه گیری کلـی و پیشنهادها
در این تحقیق و تحقیقات محققان دیگر مشخص گردید که فراوانی ژن stx1 از ژن stx2 بیشتر میباشد. به‌این‌ترتیب میتوان بیان نمود که الگوی ژنتیکی غالب stx1 میباشد. سروتیپ بسیار مهم اشریشیاکلی مولد شیگاتوکسین E. coli O:157 H:7 میباشد که بهطور طبیعی در گاوسانان وجود دارد. مطالعات نشان داده است که حداکثر دفع این باکتری از طریق مدفوعی طی تابستان و اوایل پاییز صورت میگیرد و از صفر تا 61 درصد در مزارع دامی متغیر است و همچنین تحقیقات نشان میدهد که بیشترین میزان جداسازی این باکتری در ماههای گرم سال صورت میگیرد. با توجه به دوز عفونی اندک سویه های مولد شیگاتوکسین باکتری اشریشیاکلی پایش مستمر و همزمان انواع نمونههای مواد غذایی و کلینیکی در تمام نقاط کشور توصیه می شود.
تقـدیر و تشـکر
از تمامی کسانی که در جمع آوری نمونه برای این پژوهش یاری رساندهاند تشکر مینماییم.
تعارض منافع
هیچگونه تضاد منافعی بین نویسندگان وجود ندارد و این مقاله با اطلاع و هماهنگی آنها ارسال شده است.
مرور کتاب: پژوهشی اصیل |
دریافت: 1401/3/7 | پذیرش: 1401/3/31 | انتشار: 1401/3/30
دریافت: 1401/3/7 | پذیرش: 1401/3/31 | انتشار: 1401/3/30
فهرست منابع
1. Xia X, Meng J, McDermott PF, Ayers S, Blickenstaff K, Tran TT, Abbott J, Zheng J, Zhao S. Presence and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli and other potentially diarrheagenic E. coli strains in retail meats. Applied and environmental microbiology. 2010;76(6):1709-17. [DOI:10.1128/AEM.01968-09] [PMID] [PMCID]
2. Mora A, Blanco M, Blanco JE, Dahbi G, López C, Justel P, Alonso MP, Echeita A, Bernárdez MI, González EA, Blanco J. Serotypes, virulence genes and intimin types of Shiga toxin (verocytotoxin)-producing Escherichia coli isolates from minced beef in Lugo (Spain) from 1995 through 2003. Bmc Microbiology. 2007;7(1):1-9. [DOI:10.1186/1471-2180-7-13] [PMID] [PMCID]
3. Wang J, Zhang H, Allen RD. Overexpression of an Arabidopsis peroxisomal ascorbate peroxidase gene in tobacco increases protection against oxidative stress. Plant and Cell Physiology. 1999;40(7):725-32. [DOI:10.1093/oxfordjournals.pcp.a029599] [PMID]
4. Ali, MY, Rahman MT, Islam MA, Choudhury KA and Rahman MA. Characteristics of E. coli isolates of human and animal origin. Progressive Agriculture. 1998:9: 221-24
5. Adwan K, Abu-Hasan N, Essawi T, Bdir M. Isolation and characterisation of Shiga toxigenic Escherichia coli strains from northern Palestine. Journal of medical microbiology. 2002;51(4):332-5. [DOI:10.1099/0022-1317-51-4-332] [PMID]
6. Goldwater PN, Bettelheim KA. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC medicine. 2012;10(1):1-8. [DOI:10.1186/1741-7015-10-12] [PMID] [PMCID]
7. Kerrn MB, Klemmensen N, Frimodt-Moller F. Susceptibility of Danish Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections and bacteraemia, and distribution of sul genes conferring sulphonamide resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2002;50:513-6. [DOI:10.1093/jac/dkf164] [PMID]
8. Heiman KE, Mody RK, Johnson SD, Griffin PM, Gould LH. Escherichia coli O157 outbreaks in the United States, 2003-2012. Emerging infectious diseases. 2015;21(8):1293 [DOI:10.3201/eid2108.141364] [PMID] [PMCID]
9. Bakhtiari S, Mahmoudi H, Seftjani SK, Amirzargar MA, Ghiasvand S, Ghaffari ME, Adabi M. Antibiotic resistance pattern and phylogenetic groups of the uropathogenic Escherichia coli isolates from urinary tract infections in Hamedan, west of Iran. Iranian Journal of Microbiology. 2020;12(5):388.. [DOI:10.18502/ijm.v12i5.4598] [PMID] [PMCID]
10. Karmali MA. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clinical microbiology reviews. 1989;2(1):15-38. [DOI:10.1128/CMR.2.1.15] [PMID] [PMCID]
11. Ziauddini A H, Gholami-Ahangaran M, Ahmadi-Dastgerd A I. Detection of virulence genes of intimin, hemolysin and shigatoxin in Escherichia coli isolated from Pscittacin. NCMBJ. 2020; 10 (38) :61-68
12. Ostroff SM, Griffin PM, Tauxe RV, Shipman LD, Greene KD, Wells JG, LEWIS JH, Blake PA, Kobayashi JM. A statewide outbreak of Escherichia coli 0157: H7 infections in Washington State. American Journal of Epidemiology.1990 1;132(2):239-47. [DOI:10.1093/oxfordjournals.aje.a115653] [PMID]
13. Gupta B, Ghatak S, Gill JP. Incidence and virulence properties of E. coli isolated from fresh fish and ready-to-eat fish products. Veterinary World. 2013;6(1). [DOI:10.5455/vetworld.2013.5-9]
14. Barkocy-Gallagher GA, Edwards KK, Nou X, Bosilevac JM, Arthur TM, Shackelford SD, Koohmaraie M. Methods for recovering Escherichia coli O157: H7 from cattle fecal, hide, and carcass samples: sensitivity and improvements. Journal of food protection. 2005;68(11):2264-8. [DOI:10.4315/0362-028X-68.11.2264] [PMID]
15. Kargar M, Dianati P, Homayoon M, Jamali H. Isolation, characterization and antibiotic resistance of shiga toxin-producing Escherichia coli in hamburger and evolution of virulence genes stx1, stx2, eaeA and hly by multiplex PCR. Journal of Fasa University of Medical Sciences. 2013;3(3):208-14.
16. Sanath Kumar H, Otta SK, Karunasagar I, Karunasagar I. Detection of Shiga‐toxigenic Escherichia coli (STEC) in fresh seafood and meat marketed in Mangalore, India by PCR. Letters in Applied Microbiology. 2001 Nov 6;33(5):334-8. [DOI:10.1046/j.1472-765X.2001.01007.x] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
اخلاق نشر
این نشریه با احترام به قوانین اخلاق در نشریات تابع قوانین کمیتۀ اخلاق در انتشار (COPE) می باشد و از آیین نامه اجرایی قانون پیشگیری و مقابله با تقلب در آثار علمی پیروی می نماید.
