دوره 2، شماره 1 - ( 3-1401 )
جلد 2 شماره 1 صفحات 45-37 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Behshood P, tajbakhsh E, Nourbakhsh F. Prevalence of enterocin genes in Enterococcus faecium strains isolated from red meat in Shahrekord, Iran. Zoonosis 2022; 2 (1) :37-45
URL: http://zoonosis.ir/article-1-38-fa.html
URL: http://zoonosis.ir/article-1-38-fa.html
بهشود پریسا، تاجبخش الهه، نوربخش فهیمه. بررسی فراوانی ژنهای انتروسین در جدایه های انتروکوکوس فاسیوم جدا شده از گوشت قرمز در شهرکرد. مجله بيماری های قابل انتقال بين انسان و حيوان. 1401; 2 (1) :37-45
دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد ، ee_tajbakhsh@yahoo.com
متن کامل [PDF 605 kb]
(165 دریافت)
| چکیده (HTML) (456 مشاهده)
متن کامل: (37 مشاهده)
مقدمه
انتروکوکها از انواع باکتریهای منتقله از مواد غذایی به شمار می‌روند و بهطور وسیعی در محیط پراکنده هستند، این باکتریها معمولاً در دستگاه گوارش انسان یا حیوانات، در آب، خاک، گیاهان و سبزیجات ساکن میباشند (1 و 2). انتروکوکها بهعنوان بخش مهمی از میکروفلور طبیعی بسیاری از فرآوردههای لبنی تشخیص داده شده و در بعضی از پنیرها؛ آنها بر لاکتوباسیل‌ها و لاکتوکوکسی‌ها غالب هستند. این باکتریها کاربردهای مهمی در صنعت لبنیات دارند و بهطور فراوان در محصولات لبنی یافت میشوند (5-3). آنها هم‌چنین قسمتی از فلور میکروبی طبیعی روده بعضی از پستانداران و انسان را تشکیل میدهند. مقاومت استثنایی این باکتریها باعث توانایی رشد آنها در محیط خارج رودهای میگردد و میتوانند در محیطهای اسیدی و قلیایی رشد کنند. انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکوس فاسیوم و انتروکوکوس دورانس گونههایی هستند که بیشترین فراوانی را در بین سایر گونهها به خود اختصاص داده‌اند (3، 4 و 6). انتروکوکوسها نه تنها یکی از اعضای مهم فلور نرمال دستگاه گوارش اکثر موجودات خونگرم نظیر انسان هستند، بلکه توانایی ایجاد زمینه‌های گسترده‌ای از بیماریهای عفونی را دارا هستند و بهعنوان یکی از عوامل عمده ایجادکننده عفونت‌های جدید در بیماران بستری در بیمارستان مطرح میباشند. شایع‌ترین عوامل مسبب عفونت‌های جدید در بیمارستانها، انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم میباشند (3 و 7). بسیاری از فرآوردههای گوشتی تخمیر شده نیز حاوی انتروکوک هستند و فواید زیادی ازجمله سهم آنها در رسیدن و بهبود عطر، خواص پروبیوتیک و تولید مواد ضد میکروبی به آنها نسبت داده شده است (8). مقاومت نسبت به درجه حرارت پاستوریزه شدن؛ سازش‌پذیری به انواع محیط‌ها و شرایط مختلف رشد (درجه حرارت بالا و پایین، گستره pH و تحمل غلظت نمک) از خصوصیات انتروکوکها میباشد. انواع زیادی از میکروارگانیسمها یا توکسینهای آنها با مکانیسمهای مختلف در ایجاد بیماریهای منتقله از غذا نقش دارند. پژوهش‌های متعدد حاکی از آن است که گونه‌های تولیدکننده باکتریوسینها شامل: لاکتوباسیلوس[1]، لاکتوکوکوس[2]، استرپتوکوکوس[3] و انتروکوکوس میباشند (9 و 10). باکتریوسینها؛ پپتیدهای کوچکی با فعالیت ضد میکروبی علیه باکتریهای گرم مثبت شامل: باکتریهای عامل فساد یا باکتریهای بیماریزا میباشند و سریعاً بهوسیله پروتئازها در دستگاه گوارش انسان تجزیه میشوند (11 و 12). باکتریوسینهای جداشده از باکتریهای اسیدلاکتیک، به چهار گروه تقسیم میشوند و به تازگی گروهی از آنها شناسایی شده و در گروهV قرار میگیرند. کلاس I باکتریوسینها پپتیدهای ممانعت کننده کوچکی میباشند. کلاس ΙΙ باکتریوسینها شامل پروتئین‌های کوچک و مقاوم به حرارت میباشند و شامل کلاس ΙΙa، کلاس ΙΙb و کلاس ΙΙc میباشند؛ کلاس ΙΙΙ باکتریوسین ها شامل پروتئین‌های بزرگ میباشد که مقاوم به حرارت نمی‌باشند؛ کلاس IV باکتریوسینها بهعنوان باکتریوسینهای پیچیده حاوی چربی یا کربوهیدرات میباشند. باکتریوسین تولیدشده توسط انتروکوکوسها را، انتروسین[4] می‌نامند. انتروسینها در کلاس I، کلاسIIa ، کلاسIIc و کلاس III قرار داده میشوند (4، 13 و 14). انتروسینها عمدتاً توسط انتروکوکوس فاسیوم، انتروکوکوس فکالیس ترشح میشوند (4 و 15). انتروسینها مانند بیشتر باکتریوسینها غشاء سیتوپلاسمی را هدف اولیه قرار میدهند؛ آنها در غشاء سیتوپلاسمی منفذ ایجاد کرده و باعث از بین رفتن آن میشوند (4). مطالعات متعدد نشان میدهد انتروسینها باعث کاهش باکتریهای بیماریزا در دستگاه گوارش حیوانات میشوند (4 و 15). به دلیل فعالیت این ترکیبات علیه پاتوژنهای منتقل‌شونده از طریق مواد غذایی و نیز تقاضای مصرف‌کنندگان برای حفاظت طبیعی بیشتر، باکتریوسینها بهعنوان نگهدارنده‌های زیستی در مواد غذایی پیشنهاد میشوند و استفاده از آنها در مواد غذایی مورد مطالعه فراوان قرارگرفته است (13 و 16). از آنجا که تاکنون تحقیقی در مورد فراوانی ژنهای انتروسین L50A و L50B تولید شده توسط انتروکوکوس فاسیوم در گوشت قرمز در شهرستان شهرکرد صورت نگرفته است در این تحقیق بر آن شدیم تا به فراوانی این ژنها در جدایههای انتروکوکوس فاسیوم جداشده از گوشت قرمز در شهرستان شهرکرد بپردازیم.
مواد و روشها
جمع‌آوری نمونهها
در این تحقیق سویههای باکتری انتروکوکوس فاسیوم طی شش ماه از 80 نمونه گوشت قرمز از مراکز عرضه گوشت بازار شهرکرد جمع‌آوری شد.
جداسازی سویههای جنس انتروکوکوس
برای جداسازی باکتریهای انتروکوکوس از محیط کشت اختصاصی کانامایسین اسکولین- آزیدآگار استفاده شد. برای این منظور پنج گرم از هر نمونه گوشت توزین و با 10 میلی‌لیتر بافر PBS مخلوط و یکنواخت گردید. سپس مقدار 300 میکرولیتر از محلول مورد نظر در یک پلیت حاوی محیط کانامایسین اسکولین آگار پخش گردید و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. کلنی‌های رشد یافته در هر پلیت پس از سپری شدن مدت گرمخانه‌گذاری مورد بررسی قرار گرفتند (17).
شناسایی با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی
تمام سویهها به وسیله رنگ‌آمیزی گرم، تست کاتالاز، اکسیداز، رشد در حضور 5/6 درصد نمک و تخمیر قندهای آرابینوز، مانیتول، سوربیتول، لاکتوزو سوربوز تعیین هویت گردیدند. انتروکوکوس فاسیوم کوکسی گرم مثبت، کاتالاز منفی و بی‌حرکت میباشد. قندهای ساکارز، لاکتوز، مالتوز و مانیتول را تخمیر می‌کند اما قادر به تخمیر قندهای سوربیتول و زایلوز نمی‌باشد. هم‌چنین قادر به هیدرولیز محیط بایل اسکولین آگار نیز میباشد (6).
تشخیص مولکولی جنس و گونه باکتریهای جدا شده
در این تحقیق برای تشخیص جنس انتروکوکوس از واکنش زنجیره پلیمراز مرتبط با 16srRNA و نیز جهت شناسایی گونه سویههایی که از طریق PCR جنس آنها انتروکوکوس تشخیص داده شده است، از واکنش زنجیره پلیمراز ژن سوپر اکسید دیسموتاز وابسته به منگنز استفاده میشود. استخراج DNAبا استفاده کیت استخراج DNA (شرکت سینا ژن)[5]و طبق راهنمای آن استخراج شد. واکنش PCR برای جنس انتروکوکوس و گونه فسیوم مشترک بوده و به شرح زیر در حجم نهایی 25 میکرولیتر متشکل ازDNA استخراج شده 1 میکرو لیتر، PCR buffer 10x(5/2 میکرولیتر)، 1 میکرولیتر dNTP1 (mM 10)، (mM50) ) Mgcl2 3/0 میکرولیتر(، هرکدام از پرایمرهای F و ) R1 میکرولیتر) ، آنزیم تک پلیمراز( 2/0 میکرولیتر )Smar Taq DNA Polymerase و 5/18میکرولیتر آب مقطر صورت گرفت. برنامه واکنش زنجیره پلیمراز برای تکثیر ژن 16srRNA و ژن فسیوم بدین شرح بود: 5 دقیقه دناتوراسیون اولیه در 95 درجه سلسیوس، سپس محصولات با 30 سیکل از دناتوراسیون در 95 درجه سلسیوس برای 30 ثانیه، اتصال در 55 درجه سلسیوس برای یک دقیقه و گسترش در 72 درجه سلسیوس برای یک دقیقه تکثیر یافتند. چهار میکرولیتر از محصولات واکنش زنجیره پلیمراز در ژل آگارز دو درصد الکتروفورز شده و سپس با رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید مشاهده شد (6).
آزمایش PCR بهمنظور ردیابی ژنهای انتروسین L50A و L50B در جدایه های انتروکوکوس فاسیوم
بهمنظور بررسی فراوانی ژن مربوط به انتروسین‌های L50A و L50B تولیدشده توسط باکتری از توالی پرایمرهای نشان داده شده در جدول شماره یک استفاده شد. با توجه به نزدیک بودن اندازه باندها برای هر ژن واکنش PCR جداگانه انجام شد. واکنش PCR برای هر ژن در حجم نهایی 25 میکرو صورت گرفت (18).
جدول 1. توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ردیابی ژنها
نتـایج
ردیابی ژن 16srRNA انتروکوکوس
بهمنظور تشخیص قطعی جنس انتروکوکوس در حضور توالی ژن 16srRNA ، باکتریهای جداشده مورد بررسی قرار گرفتند. تمامی نمونهها با داشتن باند 733 جفت بازی مثبت تشخیص داده شدند. نتایج در شکل شماره یک نشان داده شده است.
در این تحقیق براساس آزمایشات مولکولی میکروبی از مجموع 80 نمونه گوشت مورد مطالعه 66 نمونه (5/82 درصد) گوشت آلوده به انتروکوک شناسایی شد که تعداد 35 نمونه (75/43 درصد) آلوده به باکتری انتروکوکوس فاسیوم تشخیص داده شدند. شکل شماره دو الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی گونه انتروکوکوس فاسیوم را نشان میدهد.
شکل 1. الکتروفورز محصولات PCR ژن 16srRNA انتروکوکوس. ستون M: مارکر 1000 جفت بازی فرمنتاز. ستون 1 :کنترل منفی، ستون‌های 5-2: باند 733 جفت بازی مربوط به نمونههای مورد بررسی
شکل 2. الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی گونه انتروکوکوس فاسیوم. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 1: کنترل منفی، ستون‌های (6-2): نمونه مثبت مورد بررسی واجد باند 214 جفت باز
نتایج مربط به ردیابی ژنهای انتروسین L50A و L50B در جدایههای انتروکوکوس فاسیوم
در این تحقیق از 35 ایزوله انتروکوکوس فاسیوم جدا شده از گوشت قرمز، ژن مربوط به انتروسین L50A در 15 ایزوله (85/42 درصد) و ژن مربوط به انتروسین L50B در 14 ایزوله (40 درصد) گزارش گردید (شکل 3 و 4).
شکل 3. الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی ژن مربوط به L50A. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 1: کنترل منفی، ستون‌های (2-4): نمونههای مثبت مورد بررسی واجد باند 135 جفت باز
شکل 4. الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی ژن مربوط به L50B. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 7: کنترل منفی، ستون‌های (1-6): نمونههای مثبت مورد بررسی واجد باند 280جفت باز
بحث
توانایی انتروکوکها جهت تولید باکتریوسینها) پپتیدهای ضد میکروبی مترشحه به خارج( سنتز شونده بهصورت ریبوزومی بهخوبی شناخته‌شده است. فراوانی و تنوع بالای ژنهای ساختاری انتروسین به همراه احتمال بالای بروز ترکیب ژنها در بین سویهها، منجر به افزایش امکان جداسازی سویههای تولیدکننده باکتریوسین مؤثر جهت استفاده در علوم پزشکی، صنایع غذایی، پروبیوتیک جهت ارتقاء سلامت حیوانات یا انسان و نیز به‌کارگیری در دامپزشکی شده است (17 و 19). اخیراً انتروسینها به علت قابلیت استفاده از آنها بهعنوان نگهدارنده‌های زیستی در مواد غذایی انسانی و حیوانی بسیار مورد توجه قرارگرفته‌اند (5، 7، 9 و 17). مطالعات مختلف توانایی انتروسینها یا سویههای تولیدکننده انتروسینها را درکنترل یا کاهش باکتریهای پاتوژن در مسیر گوارشی (معده‌ای - رودهای) انسان و حیوانات (گونه‌های کمپیلوباکتر، سالمونلا و اشریشیاکلی) اثبات کرده‌اند (7 و 20). انتروسینها غشاء سیتوپلاسمی را هدف اولیه قرار میدهند و باعث از بین رفتن آن میشوند (4 و 12). در این تحقیق از مجموع 80 نمونه مورد مطالعه 66 نمونه (5/82 درصد) آلوده به انتروکوک شناسایی شد که تعداد 35 نمونه (75/43 درصد) آلوده به باکتری انتروکوکوس فاسیوم تشخیص داده شدند. از 35 ایزوله انتروکوکوس فاسیوم جداشده از گوشت قرمز، ژن مربوط به انتروسین L50A در 15 ایزوله (85/42 درصد) و ژن مربوط به انتروسین L50B در 14 ایزوله (40 درصد) گزارش گردید. در بیشتر تحقیقات انجام شده در سراسر جهان، گروهبندی و شناسایی سویههای انتروکوک با استفاده از تستهای بیوشیمیایی و فنوتیپیک، تنها برای سویههایی مشخص که معمولا از نمونههای انسانی جدا می شوند انجام میشود؛ بنابراین ممکن است شناسایی دقیق سویههای جداشده از منابع غیر انسانی به دلیل حضور همزمان چند گونه در یک نمونه، به روش بیوشیمیایی میسر نباشد. برای تشخیص جنس انتروکوکوس همانند سایر جنسهای باکتریایی معمولا از واکنش PCR مرتبط با16s rRNA استفاده میشود. در این تحقیق نیز برای تایید جدایههای انتروکوکوس و انتروکوکوس فکالیس از تکنیک PCR استفاده شد، که صالحی و همکاران نیز از این تکنیک جهت تایید جدایههای خود استفاده کردند (6). اوزدمیر و همکاران، فراوانیهای ژن انتروسین A،B ، P وL50A/B درایزوله‌های انتروکوک جداشده از منابع مختلف به ترتیب 100 درصد، 1/98 درصد، 2/72 درصد و 9/62 درصدگزارش کردند که نتایج این تحقیق برخلاف نتایج تحقیق ما است (21). استرومپفوا و همکاران نیز جهت بررسی حضور ژنهای انتروسین L50B، P،B وA را در 427 سویه انتروکوکسی از منشأ مختلف (حیوان و غذا) از تکنیک PCR استفاده کردند، بر اساس نتایج آنها 234 سویه حاوی یک یا چند ژن ساختمانی انتروسین بودند. انتروسین‌های Aو P بیشترین ژنهای ساختمانی یافت شده در بین سویههای انتروکوکوس بودند. ژن انتروسین A بیشتر در میان سویههای انتروکوکوس فاسیوم یافت شد. ولی ژنهای انتروسین L50B، B، P بیشتر در هر دو سویه انتروکوکوس فاسیوم و انتروکوکوس فکالیس یافت شدند (22). صالحی و همکاران فراوانی ژن ساختاری انتروسین A، را 8/73 درصد در نمونه های حیوانی گزارش کردند (6). تفاوت درصد حضور ژن های انتروسین در تحقیقات مختلف احتمالا به دلیل متفاوت بودن حیوانات و منابع مورد بررسی و نیز تفاوت اقلیم های جغرافیایی میباشد.
نتیجه گیری کلـی و پیشنهادها
تحقیقات بسیار محدودی در مورد فراوانی ژنهای انتروسین L50A و L50B صورت گرفته است. تحقیق حاضر حاکی از شیوع نسبتاً زیاد این ژنها در ایزولههای انتروکوکوس فاسیوم جداشده از گوشت قرمز میباشد. با توجه به شیوع نسبتاً زیاد ژنهای انتروسین L50A و L50B در ایزولههای انتروکوکوس فاسیوم جدا شده از گوشت قرمز تحقیقات بیشتر جهت بررسی خواص ضد میکروبی این ترکیبات ضروری به نظر میرسد.
تقـدیر و تشـکر
از تمامی کسانی که در نگارش این مقاله یاری رساندهاند تشکر مینماییم.
تعارض منافع
هیچگونه تضاد منافعی بین نویسندگان وجود ندارد و این مقاله با اطلاع و هماهنگی آنها ارسال شده است.
انتروکوکها از انواع باکتریهای منتقله از مواد غذایی به شمار می‌روند و بهطور وسیعی در محیط پراکنده هستند، این باکتریها معمولاً در دستگاه گوارش انسان یا حیوانات، در آب، خاک، گیاهان و سبزیجات ساکن میباشند (1 و 2). انتروکوکها بهعنوان بخش مهمی از میکروفلور طبیعی بسیاری از فرآوردههای لبنی تشخیص داده شده و در بعضی از پنیرها؛ آنها بر لاکتوباسیل‌ها و لاکتوکوکسی‌ها غالب هستند. این باکتریها کاربردهای مهمی در صنعت لبنیات دارند و بهطور فراوان در محصولات لبنی یافت میشوند (5-3). آنها هم‌چنین قسمتی از فلور میکروبی طبیعی روده بعضی از پستانداران و انسان را تشکیل میدهند. مقاومت استثنایی این باکتریها باعث توانایی رشد آنها در محیط خارج رودهای میگردد و میتوانند در محیطهای اسیدی و قلیایی رشد کنند. انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکوس فاسیوم و انتروکوکوس دورانس گونههایی هستند که بیشترین فراوانی را در بین سایر گونهها به خود اختصاص داده‌اند (3، 4 و 6). انتروکوکوسها نه تنها یکی از اعضای مهم فلور نرمال دستگاه گوارش اکثر موجودات خونگرم نظیر انسان هستند، بلکه توانایی ایجاد زمینه‌های گسترده‌ای از بیماریهای عفونی را دارا هستند و بهعنوان یکی از عوامل عمده ایجادکننده عفونت‌های جدید در بیماران بستری در بیمارستان مطرح میباشند. شایع‌ترین عوامل مسبب عفونت‌های جدید در بیمارستانها، انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم میباشند (3 و 7). بسیاری از فرآوردههای گوشتی تخمیر شده نیز حاوی انتروکوک هستند و فواید زیادی ازجمله سهم آنها در رسیدن و بهبود عطر، خواص پروبیوتیک و تولید مواد ضد میکروبی به آنها نسبت داده شده است (8). مقاومت نسبت به درجه حرارت پاستوریزه شدن؛ سازش‌پذیری به انواع محیط‌ها و شرایط مختلف رشد (درجه حرارت بالا و پایین، گستره pH و تحمل غلظت نمک) از خصوصیات انتروکوکها میباشد. انواع زیادی از میکروارگانیسمها یا توکسینهای آنها با مکانیسمهای مختلف در ایجاد بیماریهای منتقله از غذا نقش دارند. پژوهش‌های متعدد حاکی از آن است که گونه‌های تولیدکننده باکتریوسینها شامل: لاکتوباسیلوس[1]، لاکتوکوکوس[2]، استرپتوکوکوس[3] و انتروکوکوس میباشند (9 و 10). باکتریوسینها؛ پپتیدهای کوچکی با فعالیت ضد میکروبی علیه باکتریهای گرم مثبت شامل: باکتریهای عامل فساد یا باکتریهای بیماریزا میباشند و سریعاً بهوسیله پروتئازها در دستگاه گوارش انسان تجزیه میشوند (11 و 12). باکتریوسینهای جداشده از باکتریهای اسیدلاکتیک، به چهار گروه تقسیم میشوند و به تازگی گروهی از آنها شناسایی شده و در گروهV قرار میگیرند. کلاس I باکتریوسینها پپتیدهای ممانعت کننده کوچکی میباشند. کلاس ΙΙ باکتریوسینها شامل پروتئین‌های کوچک و مقاوم به حرارت میباشند و شامل کلاس ΙΙa، کلاس ΙΙb و کلاس ΙΙc میباشند؛ کلاس ΙΙΙ باکتریوسین ها شامل پروتئین‌های بزرگ میباشد که مقاوم به حرارت نمی‌باشند؛ کلاس IV باکتریوسینها بهعنوان باکتریوسینهای پیچیده حاوی چربی یا کربوهیدرات میباشند. باکتریوسین تولیدشده توسط انتروکوکوسها را، انتروسین[4] می‌نامند. انتروسینها در کلاس I، کلاسIIa ، کلاسIIc و کلاس III قرار داده میشوند (4، 13 و 14). انتروسینها عمدتاً توسط انتروکوکوس فاسیوم، انتروکوکوس فکالیس ترشح میشوند (4 و 15). انتروسینها مانند بیشتر باکتریوسینها غشاء سیتوپلاسمی را هدف اولیه قرار میدهند؛ آنها در غشاء سیتوپلاسمی منفذ ایجاد کرده و باعث از بین رفتن آن میشوند (4). مطالعات متعدد نشان میدهد انتروسینها باعث کاهش باکتریهای بیماریزا در دستگاه گوارش حیوانات میشوند (4 و 15). به دلیل فعالیت این ترکیبات علیه پاتوژنهای منتقل‌شونده از طریق مواد غذایی و نیز تقاضای مصرف‌کنندگان برای حفاظت طبیعی بیشتر، باکتریوسینها بهعنوان نگهدارنده‌های زیستی در مواد غذایی پیشنهاد میشوند و استفاده از آنها در مواد غذایی مورد مطالعه فراوان قرارگرفته است (13 و 16). از آنجا که تاکنون تحقیقی در مورد فراوانی ژنهای انتروسین L50A و L50B تولید شده توسط انتروکوکوس فاسیوم در گوشت قرمز در شهرستان شهرکرد صورت نگرفته است در این تحقیق بر آن شدیم تا به فراوانی این ژنها در جدایههای انتروکوکوس فاسیوم جداشده از گوشت قرمز در شهرستان شهرکرد بپردازیم.
مواد و روشها
جمع‌آوری نمونهها
در این تحقیق سویههای باکتری انتروکوکوس فاسیوم طی شش ماه از 80 نمونه گوشت قرمز از مراکز عرضه گوشت بازار شهرکرد جمع‌آوری شد.
جداسازی سویههای جنس انتروکوکوس
برای جداسازی باکتریهای انتروکوکوس از محیط کشت اختصاصی کانامایسین اسکولین- آزیدآگار استفاده شد. برای این منظور پنج گرم از هر نمونه گوشت توزین و با 10 میلی‌لیتر بافر PBS مخلوط و یکنواخت گردید. سپس مقدار 300 میکرولیتر از محلول مورد نظر در یک پلیت حاوی محیط کانامایسین اسکولین آگار پخش گردید و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. کلنی‌های رشد یافته در هر پلیت پس از سپری شدن مدت گرمخانه‌گذاری مورد بررسی قرار گرفتند (17).
شناسایی با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی
تمام سویهها به وسیله رنگ‌آمیزی گرم، تست کاتالاز، اکسیداز، رشد در حضور 5/6 درصد نمک و تخمیر قندهای آرابینوز، مانیتول، سوربیتول، لاکتوزو سوربوز تعیین هویت گردیدند. انتروکوکوس فاسیوم کوکسی گرم مثبت، کاتالاز منفی و بی‌حرکت میباشد. قندهای ساکارز، لاکتوز، مالتوز و مانیتول را تخمیر می‌کند اما قادر به تخمیر قندهای سوربیتول و زایلوز نمی‌باشد. هم‌چنین قادر به هیدرولیز محیط بایل اسکولین آگار نیز میباشد (6).
تشخیص مولکولی جنس و گونه باکتریهای جدا شده
در این تحقیق برای تشخیص جنس انتروکوکوس از واکنش زنجیره پلیمراز مرتبط با 16srRNA و نیز جهت شناسایی گونه سویههایی که از طریق PCR جنس آنها انتروکوکوس تشخیص داده شده است، از واکنش زنجیره پلیمراز ژن سوپر اکسید دیسموتاز وابسته به منگنز استفاده میشود. استخراج DNAبا استفاده کیت استخراج DNA (شرکت سینا ژن)[5]و طبق راهنمای آن استخراج شد. واکنش PCR برای جنس انتروکوکوس و گونه فسیوم مشترک بوده و به شرح زیر در حجم نهایی 25 میکرولیتر متشکل ازDNA استخراج شده 1 میکرو لیتر، PCR buffer 10x(5/2 میکرولیتر)، 1 میکرولیتر dNTP1 (mM 10)، (mM50) ) Mgcl2 3/0 میکرولیتر(، هرکدام از پرایمرهای F و ) R1 میکرولیتر) ، آنزیم تک پلیمراز( 2/0 میکرولیتر )Smar Taq DNA Polymerase و 5/18میکرولیتر آب مقطر صورت گرفت. برنامه واکنش زنجیره پلیمراز برای تکثیر ژن 16srRNA و ژن فسیوم بدین شرح بود: 5 دقیقه دناتوراسیون اولیه در 95 درجه سلسیوس، سپس محصولات با 30 سیکل از دناتوراسیون در 95 درجه سلسیوس برای 30 ثانیه، اتصال در 55 درجه سلسیوس برای یک دقیقه و گسترش در 72 درجه سلسیوس برای یک دقیقه تکثیر یافتند. چهار میکرولیتر از محصولات واکنش زنجیره پلیمراز در ژل آگارز دو درصد الکتروفورز شده و سپس با رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید مشاهده شد (6).
آزمایش PCR بهمنظور ردیابی ژنهای انتروسین L50A و L50B در جدایه های انتروکوکوس فاسیوم
بهمنظور بررسی فراوانی ژن مربوط به انتروسین‌های L50A و L50B تولیدشده توسط باکتری از توالی پرایمرهای نشان داده شده در جدول شماره یک استفاده شد. با توجه به نزدیک بودن اندازه باندها برای هر ژن واکنش PCR جداگانه انجام شد. واکنش PCR برای هر ژن در حجم نهایی 25 میکرو صورت گرفت (18).
| Genes | Oligonucleotide Sequence (5′-3’) | Size (bp) |
Annealing |
Refrences |
||
| 16srRNA Enterococcus |
TCAACCGGGGAGGGT ATTACTAGCGATTCCGG |
733 | 55 | 6 |
||
| E. faecium | ACA ATAGAAGAATTATTATCTG CGG CTG CTT TTT TGA ATT CTT CT |
214 | 55 | 6 |
||
| Enterocin L50A | ATGGGAGCAATCGCAAAA TTAAATATGTTTTTTAATCCA | 135 | 45 | 18 | ||
| Enterocin L50B | ATGGGAGCAATCGCAAAA TTAATGTCTTTTTAGCCA | 280 | 45 | 18 |
||
نتـایج
ردیابی ژن 16srRNA انتروکوکوس
بهمنظور تشخیص قطعی جنس انتروکوکوس در حضور توالی ژن 16srRNA ، باکتریهای جداشده مورد بررسی قرار گرفتند. تمامی نمونهها با داشتن باند 733 جفت بازی مثبت تشخیص داده شدند. نتایج در شکل شماره یک نشان داده شده است.
در این تحقیق براساس آزمایشات مولکولی میکروبی از مجموع 80 نمونه گوشت مورد مطالعه 66 نمونه (5/82 درصد) گوشت آلوده به انتروکوک شناسایی شد که تعداد 35 نمونه (75/43 درصد) آلوده به باکتری انتروکوکوس فاسیوم تشخیص داده شدند. شکل شماره دو الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی گونه انتروکوکوس فاسیوم را نشان میدهد.
شکل 1. الکتروفورز محصولات PCR ژن 16srRNA انتروکوکوس. ستون M: مارکر 1000 جفت بازی فرمنتاز. ستون 1 :کنترل منفی، ستون‌های 5-2: باند 733 جفت بازی مربوط به نمونههای مورد بررسی
شکل 2. الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی گونه انتروکوکوس فاسیوم. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 1: کنترل منفی، ستون‌های (6-2): نمونه مثبت مورد بررسی واجد باند 214 جفت باز
نتایج مربط به ردیابی ژنهای انتروسین L50A و L50B در جدایههای انتروکوکوس فاسیوم
در این تحقیق از 35 ایزوله انتروکوکوس فاسیوم جدا شده از گوشت قرمز، ژن مربوط به انتروسین L50A در 15 ایزوله (85/42 درصد) و ژن مربوط به انتروسین L50B در 14 ایزوله (40 درصد) گزارش گردید (شکل 3 و 4).
شکل 3. الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی ژن مربوط به L50A. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 1: کنترل منفی، ستون‌های (2-4): نمونههای مثبت مورد بررسی واجد باند 135 جفت باز
شکل 4. الکتروفورز محصولات PCR جهت ردیابی ژن مربوط به L50B. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 7: کنترل منفی، ستون‌های (1-6): نمونههای مثبت مورد بررسی واجد باند 280جفت باز
بحث
توانایی انتروکوکها جهت تولید باکتریوسینها) پپتیدهای ضد میکروبی مترشحه به خارج( سنتز شونده بهصورت ریبوزومی بهخوبی شناخته‌شده است. فراوانی و تنوع بالای ژنهای ساختاری انتروسین به همراه احتمال بالای بروز ترکیب ژنها در بین سویهها، منجر به افزایش امکان جداسازی سویههای تولیدکننده باکتریوسین مؤثر جهت استفاده در علوم پزشکی، صنایع غذایی، پروبیوتیک جهت ارتقاء سلامت حیوانات یا انسان و نیز به‌کارگیری در دامپزشکی شده است (17 و 19). اخیراً انتروسینها به علت قابلیت استفاده از آنها بهعنوان نگهدارنده‌های زیستی در مواد غذایی انسانی و حیوانی بسیار مورد توجه قرارگرفته‌اند (5، 7، 9 و 17). مطالعات مختلف توانایی انتروسینها یا سویههای تولیدکننده انتروسینها را درکنترل یا کاهش باکتریهای پاتوژن در مسیر گوارشی (معده‌ای - رودهای) انسان و حیوانات (گونه‌های کمپیلوباکتر، سالمونلا و اشریشیاکلی) اثبات کرده‌اند (7 و 20). انتروسینها غشاء سیتوپلاسمی را هدف اولیه قرار میدهند و باعث از بین رفتن آن میشوند (4 و 12). در این تحقیق از مجموع 80 نمونه مورد مطالعه 66 نمونه (5/82 درصد) آلوده به انتروکوک شناسایی شد که تعداد 35 نمونه (75/43 درصد) آلوده به باکتری انتروکوکوس فاسیوم تشخیص داده شدند. از 35 ایزوله انتروکوکوس فاسیوم جداشده از گوشت قرمز، ژن مربوط به انتروسین L50A در 15 ایزوله (85/42 درصد) و ژن مربوط به انتروسین L50B در 14 ایزوله (40 درصد) گزارش گردید. در بیشتر تحقیقات انجام شده در سراسر جهان، گروهبندی و شناسایی سویههای انتروکوک با استفاده از تستهای بیوشیمیایی و فنوتیپیک، تنها برای سویههایی مشخص که معمولا از نمونههای انسانی جدا می شوند انجام میشود؛ بنابراین ممکن است شناسایی دقیق سویههای جداشده از منابع غیر انسانی به دلیل حضور همزمان چند گونه در یک نمونه، به روش بیوشیمیایی میسر نباشد. برای تشخیص جنس انتروکوکوس همانند سایر جنسهای باکتریایی معمولا از واکنش PCR مرتبط با16s rRNA استفاده میشود. در این تحقیق نیز برای تایید جدایههای انتروکوکوس و انتروکوکوس فکالیس از تکنیک PCR استفاده شد، که صالحی و همکاران نیز از این تکنیک جهت تایید جدایههای خود استفاده کردند (6). اوزدمیر و همکاران، فراوانیهای ژن انتروسین A،B ، P وL50A/B درایزوله‌های انتروکوک جداشده از منابع مختلف به ترتیب 100 درصد، 1/98 درصد، 2/72 درصد و 9/62 درصدگزارش کردند که نتایج این تحقیق برخلاف نتایج تحقیق ما است (21). استرومپفوا و همکاران نیز جهت بررسی حضور ژنهای انتروسین L50B، P،B وA را در 427 سویه انتروکوکسی از منشأ مختلف (حیوان و غذا) از تکنیک PCR استفاده کردند، بر اساس نتایج آنها 234 سویه حاوی یک یا چند ژن ساختمانی انتروسین بودند. انتروسین‌های Aو P بیشترین ژنهای ساختمانی یافت شده در بین سویههای انتروکوکوس بودند. ژن انتروسین A بیشتر در میان سویههای انتروکوکوس فاسیوم یافت شد. ولی ژنهای انتروسین L50B، B، P بیشتر در هر دو سویه انتروکوکوس فاسیوم و انتروکوکوس فکالیس یافت شدند (22). صالحی و همکاران فراوانی ژن ساختاری انتروسین A، را 8/73 درصد در نمونه های حیوانی گزارش کردند (6). تفاوت درصد حضور ژن های انتروسین در تحقیقات مختلف احتمالا به دلیل متفاوت بودن حیوانات و منابع مورد بررسی و نیز تفاوت اقلیم های جغرافیایی میباشد.
نتیجه گیری کلـی و پیشنهادها
تحقیقات بسیار محدودی در مورد فراوانی ژنهای انتروسین L50A و L50B صورت گرفته است. تحقیق حاضر حاکی از شیوع نسبتاً زیاد این ژنها در ایزولههای انتروکوکوس فاسیوم جداشده از گوشت قرمز میباشد. با توجه به شیوع نسبتاً زیاد ژنهای انتروسین L50A و L50B در ایزولههای انتروکوکوس فاسیوم جدا شده از گوشت قرمز تحقیقات بیشتر جهت بررسی خواص ضد میکروبی این ترکیبات ضروری به نظر میرسد.
تقـدیر و تشـکر
از تمامی کسانی که در نگارش این مقاله یاری رساندهاند تشکر مینماییم.
تعارض منافع
هیچگونه تضاد منافعی بین نویسندگان وجود ندارد و این مقاله با اطلاع و هماهنگی آنها ارسال شده است.
مرور کتاب: پژوهشی اصیل |
موضوع مقاله:
بهداشت و ایمنی مواد غذایی
دریافت: 1401/4/9 | پذیرش: 1401/4/28 | انتشار: 1401/3/30
دریافت: 1401/4/9 | پذیرش: 1401/4/28 | انتشار: 1401/3/30
فهرست منابع
1. Radmehr M, Khashei Varnamkhasti K, Tajbakhsh E. Accuracy of REP-PCR Method in Genotyping of Enterococcus faecium Isolated From Red Meat as a Cause of Foodborne Infections. Armaghane Danesh. 2021;26(1):104-16.
2. Dapkevicius MdLE, Sgardioli B, Câmara SP, Poeta P, Malcata FXJF. Current trends of enterococci in dairy products: A comprehensive review of their multiple roles. 2021;10(4):821. [DOI:10.3390/foods10040821] [PMID] [PMCID]
3. Yousefi L, Ehsani M, Fazeli M, Mojgani N, Ezatpanah H. Characterization of enterocin-like substances produced by two strains of Enterococci isolated from ewe's and goat's milks. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology. 2011;6(1):33-42.
4. Mirhosseini M, Nahvi I, Emtiazi G, Tavasoli MJWASJ. Culture-dependent and culture-independent qualitative analysis of dairy products for bacteriocin production by lactic acid bacteria. World Applied Sciences Journal. 2008;5(1):20-24.
5. Ronconi MC, Merino LAJEIMC. Prevalencia de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium con resistencia de alto nivel a aminoglucósidos en las ciudades de Resistencia y Corrientes, República Argentina. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2000;18(2):71-3.
6. Salehi M, Hatami Z. Molecular Occurrence of Enterocin A Gene among Enterococcus faecium Strains Isolated from Gastro-Intestinal Tract and Antimicrobial Effect of this Bacteriocin Against Clinical Pathogens. Iranian Journal of Medical Microbiology. 2014;8(1):18-26.
7. Murray BE. The life and times of Enterococcus. Clinical Microbiology Reviews. 1990;3:46-65. [DOI:10.1128/CMR.3.1.46] [PMID] [PMCID]
8. Barbosa J, Gibbs PA, Teixeira P. Virulence factors among enterococci isolated from traditional fermented meat products produced in the North of Portugal. Food Control. 2010;21(5):651-6. [DOI:10.1016/j.foodcont.2009.10.002]
9. Cosentino S, Podda G S, Corda A, Fadda ME, Deplano M, Pisano MB. Molecular detection of virulence factors and antibiotic resistance pattern in clinical Enterococcus faecalis strains in Sardinia. Journal of preventive medicine and hygiene. 2010;51(1):31-36
10. Giraffa G. Enterococci from foods. FEMS Microbiology Reviews. 2002;26(2):163-71. [DOI:10.1111/j.1574-6976.2002.tb00608.x] [PMID]
11. De Vuyst L, Foulquié Moreno MR, Revets H. Screening for enterocins and detection of hemolysin and vancomycin resistance in enterococci of different origins. International Journal of Food Microbiology. 2003;84(3):299-318. [DOI:10.1016/S0168-1605(02)00425-7]
12. Cleveland J, Montville TJ, Nes IF, Chikindas ML. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology. 2001;71(1):1-20. [DOI:10.1016/S0168-1605(01)00560-8]
13. Pandey N, Malik RK, Kaushik JK, Singroha G. Gassericin A: a circular bacteriocin produced by lactic acid bacteria Lactobacillus gasseri. World journal of microbiology & biotechnology. 2013;29(11):1977-87. [DOI:10.1007/s11274-013-1368-3] [PMID]
14. Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall CG. Vancomycin-resistant enterococci. Clinical Microbiology Reviews. 2000;13(4):686-707. [DOI:10.1128/CMR.13.4.686] [PMID] [PMCID]
15. Christopher LP, Kapatral V, Vaisvil B, Emel G, Deveaux LC. Draft Genome Sequence of a New Homofermentative, Lactic Acid-Producing Enterococcus faecalis Isolate, CBRD01. Genome Announcements. 2014;2(2):e00147-14. [DOI:10.1128/genomeA.00147-14] [PMID] [PMCID]
16. Hickey RM, Twomey DP, Ross RP, Hill CJM. Production of enterolysin A by a raw milk enterococcal isolate exhibiting multiple virulence factors. 2003;149(3):655-64. [DOI:10.1099/mic.0.25949-0] [PMID]
17. Barzam E, Tajbakhsh E, Rahimi E. Prevalence of entrocins produced by Entrococcus faecalis isolated from traditional dairy products in Shahrekord City. Journal of Food Microbiology. 2015;2(2):79-87.
18. Kubašová I, Diep DB, Ovchinnikov KV, Lauková A, & Strompfová V. Bacteriocin production and distribution of bacteriocin-encoding genes in enterococci from dogs. International journal of antimicrobial agents. 2020;55(2):105859. [DOI:10.1016/j.ijantimicag.2019.11.016] [PMID]
19. Messi P, Guerrieri E, de Niederhäusern S, Sabia C, Bondi M. Vancomycin-resistant enterococci (VRE) in meat and environmental samples. International Journal of Food Microbiology. 2006;107(2):218-22. [DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2005.08.026] [PMID]
20. Piard JC, Desmazeaud M. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria.2: bacteriocins andother antibacterial substances. Lait. 1991;72:113-42. [DOI:10.1051/lait:199229]
21. Özdemir GB, Oryaşın E, Bıyık HH, Özteber M, Bozdoğan B. Phenotypic and genotypic characterization of bacteriocins in enterococcal isolates of different sources. Indian journal of microbiology. 2011;51(2):182-7. [DOI:10.1007/s12088-011-0143-0] [PMID] [PMCID]
22. Strompfová V, Lauková A, Simonová M, Marciňáková M. Occurrence of the structural enterocin A, P, B, L50B genes in enterococci of different origin. Veterinary Microbiology. 2008 10;132(3-4):293-301. [DOI:10.1016/j.vetmic.2008.05.001] [PMID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
اخلاق نشر
این نشریه با احترام به قوانین اخلاق در نشریات تابع قوانین کمیتۀ اخلاق در انتشار (COPE) می باشد و از آیین نامه اجرایی قانون پیشگیری و مقابله با تقلب در آثار علمی پیروی می نماید.
